意得辑国际科研发表学院

人体是一个江湖，江湖少不了纷争。

免疫系统与疾病大军，是正与邪的较量，生与死的博弈。这是一场硝烟弥漫的战局，有以「魔教教主」肿瘤细胞为首的邪魔歪道，有以免疫细胞为代表的名门正派，当然，还有各种置身事外，看热闹不嫌事大的围观群众。

图片来源：电影《终极细胞战》

肿瘤细胞所处这样复杂而混乱的环境，它有个高大上的名字——肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）。传统的肿瘤治疗方法例如化疗法和放疗法都将肿瘤作为一个整体，通过使用化合物或者放射物对其进行杀伤，然而，这种简单粗暴的方式不免错杀忠良。

种子与土壤

早在 1889 年，英国医生Stephen Paget就提出了「种子与土壤」学说，「种子」是指肿瘤细胞，「土壤」是适合肿瘤细胞生长的微环境。肿瘤的生长与转移与微环境息息相关，橘生淮南为橘，生淮北为枳，一些特定的靶器官能够提供适宜肿瘤细胞生长的微环境，从而备受「青睐」，而在另一部分器官中却不会形成肿瘤。

「种子与土壤」学说提出者Stephen Paget，图片来自于 Bing

「土壤」具体有哪些元素呢？肿瘤微环境包括肿瘤细胞周围的血管，成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞、骨髓来源的间充质干细胞等各种正常细胞，以及细胞外基质（ECM）等[1]。肿瘤细胞可以通过释放细胞外信号影响周边的微环境，促进肿瘤血管增生和抑制周边的免疫细胞，而肿瘤微环境中的免疫细胞及因子又可以影响肿瘤细胞的生长。

肿瘤细胞与肿瘤微环境间的相互关系（右图）远比正常组织中细胞和其周边的微环境复杂的多（左图）

原位检测技术在 TME 研究中的革新

随着免疫治疗以及靶向治疗这些新兴肿瘤治疗方法的逐步建立成熟，肿瘤微环境被证实在这些治疗的研究以及应用中具有重要作用。肿瘤细胞表面表达的免疫监测点相关蛋白的高低，肿瘤周边微环境中杀伤性 T 细胞、调节性 T 细胞以及巨噬细胞等在肿瘤基质以及肿瘤组织内部的浸润决定了免疫治疗是否适用，并帮助预估潜在治疗效果。然而肿瘤内不同区域，同一区域不同种类细胞（肿瘤细胞与TME炎症细胞）的基因转录翻译却存在显著差异。检测观察这些不同类型细胞之间的分布关系以及潜在相互作用首选原位检测。

TME 中多种类型细胞既可以与肿瘤细胞直接作用，也通过细胞因子/细胞趋化因子对肿瘤进行调控

作为原位检测历史悠久的免疫组化方法是通过抗原抗体结合原理，原位显现目标蛋白的定位及部分定量信息。然而免疫组化方法只能针对有限肿瘤微环境中待检测蛋白进行准确检测，原因有：

● 由于很多肿瘤及其TME中细胞的待检测靶蛋白（抗原）没有特异性结合的免疫组化检测用有效抗体；

● 细胞因子/趋化因子一旦被分泌到细胞外很难在组织中被保存乃至通过免疫组化的方法检测定位；

● 由于抗体制备的原理和流程原因导致了针对某一种抗原的抗体特异性参差不齐且结合效率差异巨大。

在选择哪种抗体的特异性最佳且结果最可信的过程中一旦出现偏差，则会对结果判读造成重要影响。例如 2016 年发表在 Histopathology 上的一篇文章中，对比临床上两个针对 c-MYC 的抗体（MYC Y69（针对 MYC 蛋白 N 端）和 9E10（针对 MYC 蛋白 C 端））对病人肿瘤样本连续切片进行检测，发现两者检测到的阳性信号分布差异很大 [2]。在使用 RNAscope 结果对 MYC 的 mRNA 进行检测后发现（如下图所示），只有 Y69 的 MYC 抗体检测到的阳性信号与 RNAscope 检测到的 mRNA 分布一致，且 Ki67（细胞增殖标记物）显示相似的分布状况。然而临床上却一直使用 9E10 MYC 抗体的结果作为检测 MYC 的金标准。

与免疫组化不同，RNA 原位杂交过程中探针与细胞中的 RNA 序列通过氢键互补配对结合并被后续显色方法检测到；与此同时，由于原位杂交的探针序列合成步骤相较于免疫组化抗体制备简单且标准化，不会出现后者抗体生产厂家间，同一厂家生产批次间以及针对靶蛋白结合部位差异间导致的检测稳定性问题，从而使得 RNA 原位杂交技术理论上可以产生稳定可靠的原位检测信息。

然而，由于 RNA 水平和蛋白水平各有其生物学信息上的优势，且传统的 RNA 原位杂交技术由于其杂交探针的设计理念以及待检测 RNA 本身容易降解等原因导致检测效率低下，多年来无法实现科研、药厂以及临床的需求。

从 2011 年开始，美国 Advanced Cell Diagnostics 公司（Bio-Techne 旗下品牌）开发的 RNAscope 产品横空出世，革新性的解决了 RNA 原位检测的问题。RNAscope 方法使用了专利设计的双 Z 探针，配套的级联放大体系以及相应的数据分析软件 ，使得该种 RNA 原位检测方法可以在石蜡，冰冻，细胞等多种样本中对单个 RNA 或者多个 RNA 进行原位定量检测。

RNAscope 技术原理示意图

在 RNAscope 方法的帮助下，肿瘤以及肿瘤微环境（TME）的原位信息逐渐清晰。

RNAscope 检测人非小细胞肺癌微环境

为了解非小细胞肺癌（NSCLC）中肿瘤细胞以及肿瘤微环境间的相互作用，ACD 公司研发团队的科研人员在两个 NSCLC TMA 上的 56 例非小细胞肺癌样本和 4 例肿瘤周边样本中既检测了 PD-L1 这一被广泛关注的程序性死亡因子配体 1 的转录情况，同时共定位了 PD1, 与 PD1、PD-L2、LAG3、CTLA4、TIM3、B7 H4、4-1BB 等其它免疫监测点的 RNA 转录情况。在非小细胞肺癌中描绘了肿瘤细胞与周边免疫细胞的分布情况。

该实验分别使用了 RNAscope 2.5 HD Assay-Red 试剂盒以及 RNAscope 2.5 HD duplex assay 试剂盒对 NSCLC 进行了系统的检测以及数据分析。单染（RNAscope 2.5 HD Assay-Red）检测结果显示 82% 的 NSCLC 中有 PD-L1 的 mRNA 转录（RNAscope 评分>= 1），RNAscope 评分>= 2 的 NSCLC 阳性病人样本占总检测癌症样本数的 56%。下图为从 56 个非小细胞肺癌样本中摘取的不同 PD-L1 转录水平的结果。

图中 Score 等级采用 RNAscope 评分法：

在得到了 PD-L1 转录结果的基础上，科研人员接着使用双染的方法在非小细胞肺癌（NSCLC）TMA 连续切片中，共定位 PD-L1+另一种免疫监测点，并进行评分。

以 PD-L1 与 LAG3 共定位的检测为例，PD-L1 主要在肿瘤细胞中转录，而 LAG3（红色信号点）在淋巴细胞中转录，主要集中在基质区域（下图）。

在定性分析（RNAscope 评分）的基础上，NSCLC 的数据被进一步通过绝对定量的方法进行了深入的分析。通过使用 HALO 软件可以对整个芯片全部组织进行绝对定量分析。下图为对 Core 1B1 中 PD-L1 和 LAG3 的分布情况进行 HALO 数据分析后得到的 LAG3 转录阳性细胞在肿瘤区域，基质区域以及整个组织块中的百分比；PD-L1 的相应数据也在同一张柱形图中展示。

除了双靶点 RNA 可见光检测外，当存在在同一切片内对多个靶标进行分析的需求时，RNAscope multiplex assay 可以满足在同一切片内进行三到四个靶点 RNA 的检测。也可以结合免疫组化与 RNAscope 方法，在一张切片中使用荧光同时定位多个靶点的 mRNA 与蛋白质。下图为使用 RNAscope 技术在人的非小细胞肺癌中内检测 IDO 的 mRNA（免疫监测点），PD-L1 的 mRNA（程序性死亡因子配体）和 CD8 蛋白（杀伤性 T 细胞）的分布。结果显示在肿瘤细胞内有 PD-L1 的 mRNA 转录（红色），在其周围有 CD8 阳性（白色）杀伤性 T 细胞的浸润，同时浸润的一些淋巴细胞内也存在 IDO（绿色）mRNA 的转录。

RNAscope 原位检测方法已经被广泛应用于肿瘤微环境的科研，药物研发，临床药效相关性等多个方面。成为继免疫组化之后又一有力的原位检测方法，为肿瘤研究提供稳定真实可靠的结果。

参考文献：

1.Tumor microenvironment: Sanctuary of the devil. Cancer Lett. 2015 Nov 1;368(1):7-13.

2.Distribution of the c-MYC gene product in colorectal neoplasia. Histopathology 2016, 69(2):222-229.

本文内容素材来源于 ACD 李娜博士，由 Bio-Techne 市场部编辑整理而成。