意得辑国际科研发表学院

对于 CAR-T 细胞疗法，发挥肿瘤杀伤作用的有效成分是 CAR 阳性的 T 细胞，因而 CAR 阳性表达率检测是 CAR-T 细胞产品质量控制的重要一环。流式细胞法是检测 CAR 阳性 T 细胞的常用手段。

R&D Systems^® 全新推出 Fluorokines™ 荧光标记重组蛋白，将荧光基团与生物活性蛋白偶联，旨在通过流式细胞仪简化 CAR-T 细胞上特异性嵌合抗原受体（CAR）的检测。R&D Systems^® 严格控制整个生产工艺，从而保证 Fluorokines™ 蛋白的批间一致性、F/P 比一致性，以及活性与未标记蛋白的一致性。

什么是 CAR-T 细胞疗法？

CAR-T 细胞疗法如日中天，并可用于治疗血液系统癌症，包括急性淋巴细胞白血病（ALL）、急性髓性白血病（AML）、淋巴瘤和多发性骨髓瘤（MM）^[1]。该细胞疗法从患者体内取出 T 细胞，对细胞进行基因工程改造，使其表达嵌合抗原受体（CAR）。CAR 是一种合成的 T 细胞受体，胞外域由抗体衍生的抗原结合 scFv（单链可变片段）组成，可与特异性靶抗原结合；胞内包含一个或多个共刺激分子，以提高 T 细胞增殖活性、细胞毒性。CAR 修饰的 T 细胞在体外扩增后，再回输到患者体内，与患者肿瘤细胞表面的特异性抗原结合并被激活，进而攻击并破坏肿瘤细胞。

CAR 结构

CAR-T 疗法流程示意图

检测 CAR 的表达是了解患者体内 CAR 阳性 T 细胞剂量的重要步骤。用荧光标记蛋白可直接染色表达相应 CAR 的靶细胞，便于通过流式细胞仪进行检测。

常用靶向抗原：CD19 和 BCMA

CAR-T 细胞表达针对不同肿瘤表面抗原（包括 CD19 和 BCMA）的 CAR。CD19 是一种抗原，广泛表达于 B 细胞来源的肿瘤上，是 CAR-T 细胞疗法最受欢迎的靶点之一 ^[1]。2021 年，两种抗 CD19-CAR-T 细胞疗法已获得中国国家药品监督管理局（NMPA）的批准：复星凯特的阿基仑赛注射液（奕凯达）以及药明巨诺的瑞基奥仑赛注射液（倍诺达）。

CAR-T 细胞治疗的第二大靶向肿瘤抗原是 B 细胞成熟抗原（BCMA）^[1]。BCMA 参与调节 B 细胞成熟和分化成浆细胞，并且在恶性浆细胞上的表达水平通常高于正常浆细胞 ^[2,3]。目前多项研究聚焦抗 BCMA CAR-T 细胞疗法用于多发性骨髓瘤的治疗，并展示出可喜的结果^[2,3]。CAR-T 细胞疗法临床试验中正在研究的其他优质靶标包括 GD2、EGF R、HER2、Mesothelin、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、Glypican-3  和  NKG2D^[1]。

Fluorokines™：点亮 CAR 阳性 T 细胞

Fluorokines™ 的主要优点是可以通过流式细胞仪直接染色并检测表达相应 CAR 的靶细胞。该方法具有高度特异性，减少了检测时间，并避免了间接检测 CAR 可能发生的非特异背景染色，如使用表位标记靶抗原和荧光标记二抗。

Fluorokines™ 用于检测 CAR 的表达。(A)CAR-T 细胞疗法的原理示意图；(B) 表达 CAR 的 T 细胞可以使用 Fluorokines™ 直接染色，并可以通过流式细胞术检测 CAR 表达的 T 细胞阳性率。(C) 将 hCD19-CAR 转导（左）或未转导（右）的 CD4 + CD8 + T 细胞，培养 11 天。用 PE-Cy7-CD4 和 Recombinant Human CD19 Fc Chimera Atto 488 Protein（货号  ATJ9269）对细胞染色，并通过流式细胞术进行检测。

Fluorokines™ 的生物活性和批间一致性检测：

• Fluorokines™ 可与相应单克隆抗体偶联的磁珠结合；

•  确保 Fluorokines™ 能通过流式细胞术对相应的 CAR-T 细胞进行染色；

• Fluorokines™ 表现出高度的批间一致性，与未经 Fc 标记的重组蛋白具有相同的高水平活性。

Recombinant Human BCMA Fc Chimera Atto 647N Protein 的生物活性和批间一致性检测。将重组人 APRIL/TNFSF13 蛋白（货号  5860-AP）以 0.1 μg/mL、100 μL/孔的用量固定，并加入指定浓度的三个独立批次的重组人 BCMA Fc Chimera Atto 647N（货号  ATM193；红色、绿色、橙色线）或未标记的重组人 BCMA Fc Chimera（货号  193-BC；蓝色线）。数据证明荧光标记和未标记蛋白具有一致的生物活性，并且三个不同批次的荧光标记蛋白的生物活性具有较高的批间一致性。

CAR 检测用 Fluorokines 一览表（略）

由于用标记的靶抗原直接检测 CAR 是目前评估 CAR 阳性 T 细胞的首选方法，R&D Systems^®  正在努力研发更多的 Fluorokines™ 荧光标记蛋白。作为替代方法，我们还能提供了 Avi-Tag 生物素化蛋白，可用荧光标记的链霉亲和素进行检测。若您无法在官网找到以上标记的蛋白，我们的定制蛋白服务团队可以与您合作，以满足您的特定研究需求。

欲了解更多详情或购买产品，请联系 Bio-Techne 销售或者各地授权代理商。

参考文献：

1.Yu, J.X. et al. (2019) Nat. Rev. Drug Discov. 18:821.

2. Mikkilineni, L, & J.N. Kochenderfer (2017) Blood 130:2594.

3. D’Agostino, M. & N. Raje (2020) Leukemia 34:21.