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宏基因组测序及 16S rDNA/18S rDNA/ITS 扩增子测序

2017-12-15 02:40:17来源:丁香园 作者:丁香通讯员

宏基因组测序(元基因组测序)
 

 宏基因组测序是对特定环境中的整个微生物群落的基因组信息进行检测,进而研究生境中微生物的群落结构、物种分类、进化关系、基因功能及微生物与生境之间的相互作用关系的一项测序技术。

宏基因组测序不依赖传统的微生物分离纯化技术,直接提取生境样本中的总DNA进行测序,为鉴定低丰度的微生物群落和获得更多新基因等提供了新的途径。



实验路线



数据分析流程





技术参数/样本要求

  • 环境及临床样本(干冰或冰袋运送)
  • 土壤≥ 10 g(污染土壤样本要适当增加送样量,20 g);粪便≥ 2 g;
  • 水体样本:滤膜(滤膜直径3-4 cm);拭子样本≥ 2个;
  • DNA(干冰或冰袋运送)
  • DNA:浓度≥ 50 ng/μL;总量≥ 2 μg;DNA要有明显主带,无降解,OD260/280= 1.8-2.0
  • 数据量 推荐6G

数据分析结果展示



案例解析

案例一 现代死水环境样本的宏基因组学研究

本研究通过宏基因组学以及生物信息学技术来研究Banyoles湖泊岩溶地区碳,与某种细菌群体紧密偶联的氮和硫的代谢途径。目前,在自养生物和异养生物钟都发现了潜在的氮固定和脱氮功能。其中,绿硫细菌科主要在碳和氮固定中发挥作用。弯曲菌目含有大量的脱氮基因。盖氏铁柄杆菌属被推测与脱氮,铁氧化,碳的固定有关。另外,盖氏铁柄杆菌属还可能与铁循环有关。拟杆菌目具有较高丰度,并且表现出潜在的将硝酸盐还原成铵盐的能力等。总之,该研究为我们提供了更详细的角度来认识缺氧环境下的微生物生态学,同时可能有助于开发新的地球化学指标来推断古老生态系统中,生物学和化学的相互作用。

原文出处:Llorens-Marès T, Yooseph S, Goll J, et al. Connecting biodiversity and potential functional role in modern euxinic environments by microbial metagenomics. ISME J. 2015, 9(7): 1648-1661.



案例二 完全肠内营养治疗儿童克罗恩式病后的宏基因组学研究

本文作者通过宏基因组测序来分析肠道微生物与儿童克罗恩氏病(Crohn's disease, CD)的之间的关系,同时分析完全肠内营养(exclusive enteral nutrition,EEN)治疗后对克罗恩氏病肠道微生物的影响。

研究发现,没有经过EEN治疗的CD病人的肠道微生物的多样性相对于正常人要低(p= 0.006)。另外,ENN治疗后会导致微生物多样性的下降,同时,细菌的群落结构较正常人也发生较大的不同。在基因功能方面,CD病人的肠道微生物较正常人更广泛。但是,其群落多样性有所下降。在CD病人中,与细胞膜转运,硫还原,和营养合成相关的基因较正常人有所不同。与生物素和硫胺素合成相关的基因丰度在EEN治疗后有所下降,而与亚精胺、腐胺生物合成的基因丰度有所增加。因此,EEN治疗CD与调节肠道微生物的多样性有关。



原文出处:Quince C, Ijaz U Z, Loman N, et al. Extensive Modulation of the Fecal Metagenome in Children With Crohn’s Disease During Exclusive Enteral Nutrition. Am J Gastroenterol. 2015, 110(12): 1718-1729. 

 

16S rDNA/18S rDNA/ITS扩增子测序
 

16S rDNA 扩增子测序:16S rDNA为原核生物中编码核糖体小亚基rRNA的DNA序列,具有9个高变区域(V1-V9)和10个保守区域,其中保守区反映细菌种属间亲缘关系,高变区反映了物种间的特异性,选择通用引物进行PCR扩增,进而通过新一代测序技术对16S rDNA的单个或多个高变区进行测序,来分析环境或者临床样本中古菌或细菌的群落结构多样性。

18S rDNA扩增子测序:18S rDNA真核生物中编码核糖体小亚基rRNA的DNA序列,具有可变区(V1-V9,没有V6区)和保守区。保守区反映生物物种间的亲缘关系,高变区反映物种间的差异。选择通用引物进行PCR扩增,进而通过新一代测序技术对18S rDNA的高变区(一般选择V4区)进行测序,来分析环境或者临床样本中真核生物群落结构多样性。

ITS扩增子测序:ITS分为两个区域:ITS1/ITS2,其中ITS1位于真核生物核糖体rDNA序列18S和5.8S之间,ITS2位于真核生物核糖体rDNA序列5.8S和28S之间。通过新一代测序技术对ITS1或者ITS2进行测序,进一步做环境微生物中真菌多样性分析。

实验路线

数据分析流程

方案策略

样本要求(技术参数)

  • 环境及临床样本(干冰或冰袋运送)
  • 土壤≥ 10 g(污染土壤样本要适当增加送样量,20 g);粪便≥ 2 g;
  • 水体样本:滤膜(0.22 µm滤膜) ≥ 2个;拭子样本≥ 2个;
  • DNA/PCR产物(干冰或冰袋运送)
  • DNA:浓度≥ 20 ng/μL;总量≥ 400 ng;DNA要有明显主带,无降解;OD260/280= 1.8-2.0
  • PCR 产物:浓度≥ 20 ng/μL,总量≥ 400 ng,片段大小< 450 bp,条带单一,无降解,无引物二聚体

数据分析结果展示

 

稀疏性曲线                                                                                          香农指数曲线



 

 

 
 

 

案例解析

案例一 乙酸盐有利于好氧颗粒污泥对发酵液中磷的富集

伯豪生物携手南开大学环境工程学院对环境微生物共同展开研究。微生物的厌氧消化(Anaerobic digestion,AD)是一种有效的,而且被广泛运用在能源和资源恢复中的生物技术。厌氧消化产生的污水以及发酵产生的发酵液中含有许多的对环境有害的有机质物质,比如易挥发的脂肪酸和矿物质元素(氮和磷),由于这些有机质物质不能被很好的处理,进而对我们的环境造成了严重的污染。本研究通过使用两个相同批次的反应器Ra和Rp,分别使用乙酸和丙酸作为额外添加碳源,来培养好氧颗粒进而去除发酵液中的磷。同时,作者通过二代测序的方法对两个反应器中的微生物多样性进行检测。结果显示,Ra反应器中的好氧颗粒具有较高的磷去除能力。微生物多样性检测结果发现,Ra反应器中拟杆菌(34%)和beta变形菌门的含量较多,推测拟杆菌(34%)和beta变形菌门可能是造成高效去除磷能力的主要原因。

原文出处:Cai W, Huang W, Li H, et al. Acetate favors more phosphorus accumulation into aerobic granular sludge than propionate during the treatment of synthetic fermentation liquor. Bioresource technol. 2016, 214: 596-603.

案例二 肠芽囊原虫可以增加人类肠道细菌微生物的多样性

本文通过二代测序平台Ion Torrent对48个肠道定植有牙囊原虫的病人的粪便样本以及48个正常人的粪便样本进行16S rDNA的V3-V5区进行测序,结果表明定植有牙囊原虫的病人的肠道细菌多样性比健康人的丰富,其中梭状芽胞杆菌比较丰富,而肠杆菌相对要少。这个结果表明,肠道中定植有牙囊原虫可以营造一个健康的肠道微生物多样性,而不会造成肠道微生物多样性的失衡。

 
 

原文出处:Audebert C, Even G, Cian A, et al. Colonization with the enteric protozoa Blastocystis is associated with increased diversity of human gut bacterial microbiota. Sci rep. 2016, 6. 

 

案例三 产道液体擦拭婴儿身体可以部分恢复剖腹产婴儿的微生物多样性

剖腹产婴儿从母体获得微生物的种类与自然分娩婴儿从母体获得的微生物的种类有很大的差别,这些微生物种类的差异回来代谢紊乱和免疫紊乱的风险,因此如何避免剖腹产造成的婴儿微生物种类变化变得十分重要,本研究用母体产道液体来对剖腹产婴儿进行擦拭,30天后通过16S rDNA测序技术对剖腹产婴儿的皮肤,口腔和肠道进行微生物的多样性检测,发现用产道液体擦拭的剖腹产婴儿的微生物多样性与自然分娩婴儿的微生物多样性相似。同时也证明了,剖腹产婴儿肠道,皮肤和口腔微生物只能部分通过从母体获得。

 

用无菌纱布将产妇产道液体擦拭剖腹产婴儿的嘴,脸及身体其他部分的操作流程



原文出处:Dominguez-Bello M G, De Jesus-Laboy K M, Shen N, et al. Partial restoration of the microbiota of cesarean-born infants via vaginal microbial transfer. Nat med, 2016.