意得辑国际科研发表学院

将一个人的 DNA 完全展开能有多长？竟可以在地球和太阳之间往返 300 多次。DNA 作为人类的重要遗传物质，其完整性和保真性对人类行使正常的生物学功能至关重要。

然而，这无疑是一项艰巨的任务，因为 DNA 会不断受到遗传毒性因素（外源性和内源性）的破坏。作为一个成熟的 DNA，它可以在大多数情况下启动自我修复程序。可一旦修复出现 bug，就可能引起突变、细胞衰老或死亡，进而导致多种癌症和神经退行性疾病等的发生^[1]。

 

DNA 损伤及修复通路示意图，图片来源：参考文献 1

因此，检测 DNA 损伤及修复，成为疾病机理研究、药物研发及筛选的重要环节。为此我们精心总结出目前常用的几种检测方法：

 

01 实验室的浪漫：彗星实验（Comet assay）

彗星实验是一种可直接定量检测单细胞 DNA 损伤的灵敏技术。它是将细胞包埋于载玻片上的低熔点琼脂糖中，裂解细胞后进行电泳，受损的 DNA 比未受损的 DNA 更容易迁移。

通过显微镜观察得到的图像神似「彗星」，头部由完整的 DNA 组成，而尾部由单链（SS）或双链（DS）的受损 DNA 组成。彗星实验中常用的指标为尾长（tail length）、尾部 DNA 含量及尾矩（tail moment），用于衡量 DNA 损伤的严重程度。

 

图片来源：Bio-Techne

R&D Systems^®的 CometAssay 标准化系统提供检测的试剂盒、仪器、软件和辅助产品，以产生高度可重复、一致的实验结果。

R&D Systems 的 CometChip^® 高通量检测平台分析 MCF-7 细胞中的 DNA 损伤。逐一添加浓度不断增加的八种不同的 DNA 破坏剂及对照组，随后使用 CometChip^® 系统评估基因组 DNA 损伤，并分析彗星尾巴迁移的 DNA 程度和数量（%Tail DNA）。数据改编自参考文献 2。

为确定 DNA 的损伤类型，我们常常将使用 DNA 修复酶的片段长度分析法（FLARE，Fragment Length Analysis using Repair Enzymes）与彗星实验联用，FLARE 分析是在检测前即加入 DNA 修复酶以修复损伤的 DNA，通过分析底物特异性来推断 DNA 损伤的类型。

通过 FLARE 分析评估人羊膜细胞的 DNA 损伤类型。用细胞培养基中制备的水溶性香烟烟雾提取物（wsCSE）处理原代人羊膜上皮细胞，分别设置 wsCSE 组、抗氧化剂 NAC + wsCSE 组以及对照组。用 FLARE 分析试剂盒中 OGG1 修复酶处理 DNA，并检测 8-oxoG 的变化，分析彗星尾巴迁移的碎片程度和数量，提示损伤类型为 ROS 氧化损伤。数据改编自参考文献 3。

 

02 双链断裂标志物：γH2AX

组蛋白 H2AX 在核小体形成、染色质重塑和 DNA 修复中发挥着重要作用。一旦双链 DNA 断裂，它在 Ser139 位点发生磷酸化，成为 γH2AX。γH2AX 可标记双链断裂的位点，并募集细胞周期检查点和 DNA 修复因子至损伤位点。

由于 γH2AX 的水平在双链断裂后数分钟内升高，因而常被用作 DNA 损伤的标志物。定量检测 γH2AX（R&D Systems^®，货号 4418-096-K）表达水平可用于评估 DNA 损伤程度。

 

03 单链断裂标志物：PAR 及 PARP

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）可检测 DNA 中的单链断裂并启动 DNA 损伤修复反应。一旦检测到单链断裂，PARP 就会与 DNA 结合并开始生成 PAR 链，作为其他 DNA 修复酶的信号。目前对于 PARP 抑制剂的研究正在不断开展，可作为多种疾病的潜在疗法，包括癌症、炎症、局部缺血和神经退行性疾病等^[4-6]。

迷迭香提取物对 PARP 抑制作用的体外分析。使用 PARP Universal Colorimetric Assay（R&D Systems^®，货号 4677-096-K）在体外评估了迷迭香提取物（实心圆圈）和 3-aminobenzamide（已知的 PARP 抑制剂，空心圆圈）对 PARP 活性的影响。数据改编自参考文献 7。

 

04 氧化 DNA 损伤：8-oxo-dG 与 SOD

在损伤、感染和发炎后，许多组织中都会产生活性氧（ROS）和活性氮（RNS）。ROS 和 RNS 引起的氧化损伤被认为是神经退行性疾病、组织损伤、癌症和衰老过程的关键因素。

8-羟基-2′ 脱氧鸟嘌呤（8-oxo-dG）是 DNA 氧化的主要产物，当 DNA 损伤剂诱导其形成后，通过碱基切除修复途径将其从 DNA 中清除，随后被转运到唾液、尿液和血浆中。因此，8-oxo-dG 是氧化 DNA 损伤和氧化应激的常用标志物。

R&D Systems^® 8-oxo-dG ELISA（货号 4380-192-K）检测试剂盒采用竞争法原理，可定量检测 DNA、血浆、尿液和唾液等样本中 8-oxo-dG 含量。

使用 HT 8-oxo-dG ELISA Kit II（货号 4380-096-K）检测小牛胸腺 DNA 中的 8-oxo-dG。在 0.5 mM H2O2 条件下，分别设置浓度递增的 CrCl3 处理组及未处理组。通过乙醇沉淀终止反应，并用 DNase I（试剂盒中已包含）和碱性磷酸酶（试剂盒中已包含）消化小牛胸腺 DNA。

超氧化物歧化酶（SOD）是一种金属酶，可将超氧自由基（O2•-）催化为过氧化氢（H2O2）和分子氧（O2），为机体抵抗氧化损伤提供了重要的防御力。通过 R&D Systems^® SOD 比色法检测试剂盒（货号 7500-100-K）可定量检测哺乳动物细胞和组织提取物中的 SOD。

总的来说，对于 DNA 损伤及修复的研究不仅可以揭开基因组有序运转的奥秘，还有助于继续研发可以拯救生命的治疗方法。选择合适的实验方法完成 DNA 的「体检」，也成为众多实验室的必备技能。Bio-Techne 提供多种 DNA 损伤检测所需的试剂、仪器、软件，为科研加油助力，现在购买更享惊喜好礼！

 

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参考文献：

[1]. Nimrat Chatterjee, et al. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. (2017) Environ Mol Mutagen, 58 (5), 235-263.

[2]. Wilk, A. et al. Extracellular NAD + enhances PARP-dependent DNA repair capacity independently of CD73 activity. (2020) Sci. Rep. 10:651.

[3]. Menon, R. et al. Senescence of primary amniotic cells via oxidative DNA damage. (2013) PLoS One 8:e83416.

[4]. Christopher J Lord，Alan Ashworth. PARP inhibitors: Synthetic lethality in the clinic. (2017) Sci. Mar 17; 355(6330): 1152-1158

[5].Leeanne, M. et al. Poly(ADP-Ribose) Prevents Pathological Phase Separation of TDP-43 by Promoting Liquid Demixing and Stress Granule Localization. (2018) Mol Cell. Sep 6; 71(5): 703-717. e9.

[6]. Weronika Wasyluk, Agnieszka Zwolak. Poly(ADP-Ribose) Prevents Pathological Phase Separation of TDP-43 by Promoting Liquid Demixing and Stress Granule Localization. (2021) J Inflamm Res. May 6; 14: 1827-1844.

[7]. Su, C. et al. Hypersensitivity of BRCA2 deficient cells to rosemary extract explained by weak PARP inhibitory activity (2017) Sci. Rep. 7:16704.